反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物

作者：孔宇，赵永席，王波，吴红，马国营

【关键词】 糖尿病肾病

Reversedphase high performance liquid chromatography assay for determining 4 kinds of markers of diabetic nephropathy in urine

【Abstract】 AIM: To establish a new reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method for assay 4 kinds of nonproteinnitrogen markers of human diabetic nephropathy (DN), creatine (Cr), creatinine (Cn), urea (U) and uric acid (Ua) in DN patients urines. METHODS: The urine samples were assayed by RPHPLC on C18 column (200 mm×4.6 mm, id 5 μm) at the ambient temperature and a wave length of 200 nm, using a 10 mmol/L pH 6.86 phosphate buffer ［consisted 30%(V/V) methanol］ as mobile phase with the flow rate of 0.9 mL/min. RESULTS: Baseline separation of the urine could be easily achieved in 5 min after a simple sample preparation. The method also displayed a high reproducibility (RSD values of retention time and peak area were no more than 3%) and the calibration curves showed good linearities in the range of 5-300 μmol/L, 10-200 μmol/L, 1-30 μmol/L, 10-1500 μmol/L for Cr, Cn, U and Ua respectively. CONCLUSION: This method has great potential for routine assay of clinical urine samples and monitoring DN early.

【Keywords】 reversed high performance liquid chromatography; diabetic nephropathy; nonprotein nitrogen; urine

【摘要】目的：建立糖尿病患者尿液中与肾病相关的非蛋白氮代谢产物(肌酸、肌酐、尿素和尿酸)的反相高效液相色谱分离分析方法. 方法：采用Agilent C18（200 mm×4.6 mm, 内径5 μm）色谱柱，流动相含30％(体积比)甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸缓冲溶液，流速0.9 mL/min，检测波长200 nm，柱温为室温. 结果：在5 min内可对患者尿液中上述4种物质同时进行测定，样品前处理简单，重现性较好(迁移时间和峰面积的RSD均≤3%)，线性范围较宽（肌酸：5~300 μmol/L, 肌酐：10~200 μmol/L, 尿素：1~30 mmol/L, 尿酸：10~1500 μmol/L）. 结论：此法完全适用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.

【关键词】反相高效液相色谱；糖尿病肾病；非蛋白氮；尿样

　0引言

糖尿病并发肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者致死的重要原因之一，已引起了人们的广泛关注. 非蛋白氮代谢产物如肌酸(creatine, Cr)、肌酐(creatinine, Cn)、尿素(urea, U)和尿酸(uric acid, Ua)即是与DN相关的几种物质. 已报道的有关这些物质的分离分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色谱法［3-6］、毛细管电泳法［7-9］等. 其中比色法和酶法通常只能测定单一的物质，而且尿液中的一些内源性物质对测定有干扰；液相色谱法则多集中在对某一种或部分物质的测定上；毛细管电泳测定这些标志物重现性有待于提高. 我们运用反相高效液相色谱法，对DN患者尿液中与DN相关的Cr, Cn, U和Ua这4种非蛋白氮代谢产物进行同时分离检测. 同时测定尿液中的4种物质目前还未见报道. 此法具有快速、灵敏度高和重现性好的特点，完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.

1和方法

1.1材料Agilent 1100液相色谱仪（美国Agilent公司）；Cr，Cn，Ua均购自Sigma公司（USA，Sigma）；甲醇为色谱纯试剂（天津第二化学试剂厂）；其余试剂均为分析纯，水为二次重蒸水.

1.2方法

1.2.1色谱条件色谱柱为Agilent C18柱（200 mm×4.6 mm,内径5 μm），流动相含体积比为30%的甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸缓冲溶液，等度洗脱，流速0.9 mL/min，检测波长200 nm，柱温为室温，进样量为10 μL.

1.2.2标准溶液的配置和尿样的处理方法Cr, Cn和U标准溶液均使用二次重蒸水配置成一定的浓度. Ua溶液的配置方法如下：取30 mg磷酸钾，溶解在40 mL重蒸水中，加热至60℃，使其完全溶解，精确称取Ua 28 mg,溶解于热磷酸钾溶液中，冷却至室温，移入100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，贮存在棕色瓶中保存. 尿液样品的处理方法：取新鲜的尿液用水稀释1倍后待用. 所有溶液每周更换1次，使用前均过0.45 μm的水相膜后再用于色谱分析.

2结果

2.1色谱条件的优化固定其它色谱条件不变，分别改变缓冲液的pH值、流动相（pH 6.86）中甲醇比例、流动相中缓冲液浓度和流动相的流速，考察了其对4种物质分离的影响. 四种物质的分离随pH、甲醇比例、磷酸缓冲液浓度和流动相的流速的变化情况分别如图1，2所示.

A：流动相pH；B：甲醇比例.

图1流动相pH和甲醇比例对几种标志物保留时间的影响（略）

A：磷酸缓冲液浓度；B：流速. R12: U和Cr之间的分离度; R23: Cr和Ua之间的分离度; R34: Ua和Cn之间的分离度.

图2流动相中磷酸缓冲液浓度以及流速对分离的影响（略）

2.2方法重现性在选定的色谱条件下，连续5次测定了同一样品，对各物质的迁移时间、峰面积和峰高的重现性进行了考察，结果表明,各物质的迁移时间的变化很小（保留时间的RSD值见表1），方法的重现性较好.

2.3定量标准曲线、回收率以及最低检测限配置一系列浓度的标准溶液，按上述色谱条件进行分析测定，将所测的峰面积对物质的浓度作回归分析，其线性相关系数均大于0.9992；以信噪比(S/N)为3来测定检测限；添加已知量标样，测定其含量，计算方法的回收率(表1).

表1方法的相关参数（略）

2.4样品分析在选定的色谱条件下，对标准溶液和实际DN尿样进行了分析，5 min内4种物质即可达到完全分离，分离结果如图3所示，实际DN尿样中的4种物质得到了很好的检出，尿样里的其他物质对分析无干扰. 采用此法对某糖尿病患者以及正常人尿样中的Cn, Cr, U，Ua分别进行测定，结果糖尿病患者尿样中Cn, Cr, U，Ua的含量分别为10.3, 0.68, 26.7，2.1 μmol/mL, 正常人尿样中的Cn, U，Ua的含量分别为7.7, 36.7，1.0 μmol/mL,而Cr未被检出.

图3标准溶液(A)和尿样(B)的色谱图（略）

3讨论

3.1pH对分离的影响其从图1A中可以看出，在pH 3.5~7.5范围内U和Cr的出峰时间和顺序几乎不随pH的变化而变化；而对于Cn和Ua来说，其出峰时间和顺序都随pH的变化而变化，当pH接近5.5时，两者的出峰时间近乎相同，得不到分离. 因此，在选择最佳pH时，主要考虑Cn和Ua之间的分离度（Rs）以及分析的效率（分析周期短），最终选择缓冲能力最强，分离度较佳（Rs＝4.1）的pH 6.86为优化的分离pH.

3.2流动相中甲醇比例的选择从图1B中可以看出，随着流动相中甲醇比例的增加，各标志物的出峰时间随之减少，分离周期大大缩短，但与此同时各标志物间的分离度也相应减少，当流动相中甲醇的比例大于40％时，各物质几乎同时被洗脱出来，难以达到分离. 最终选择流动相中甲醇含量为30％为较佳的比例（此时分析周期较短，各物质间分离度均大于2.0）.

3.3流动相中缓冲液浓度对分离的影响从图2A中可以看出，随着缓冲液浓度的增加，各标志物的峰面积随之减小. 而缓冲液浓度为5和10 mmol/L时峰面积比较接近，最终选择缓冲能力较强的10 mmol/L为最佳缓冲液浓度.

3.4流速的'优化从图2B中可以看出，当流速从0.4 mL/min增加到0.9 mL/min时，各物质间的分离度是逐渐增加的，并且分析周期变短；而当流速从0.9 mL/min增加到1.0 mL/min后